Hybrydyzacja in situ

Plik hybrydyzacja in situ to metoda wykrywania aberracji chromosomowych. Niektóre chromosomy są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i związane z sondą DNA. Technika ta jest wykorzystywana do prenatalnej diagnostyki mutacji genów.

Co to jest hybrydyzacja in situ?

W przypadku hybrydyzacji in situ niektóre chromosomy są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i wiążą się z sondą DNA. Technika ta jest wykorzystywana do prenatalnej diagnostyki mutacji genów.

W przypadku hybrydyzacji in situ lub Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ kwasy nukleinowe z RNA lub DNA są wykrywane w określonych tkankach lub komórkach za pomocą metod genetyki molekularnej. Zwykle ten rodzaj diagnozy służy do wykrycia strukturalnej lub liczbowej nieprawidłowości chromosomalnej podczas ciąży.

W tym celu używa się sztucznie wytworzonej sondy, która sama składa się z kwasu nukleinowego. Następnie wiąże się z kwasami nukleinowymi w organizmie poprzez parowanie zasad. To wiązanie jest rozumiane przez termin hybrydyzacja. Dowody opierają się na żywej strukturze pacjenta i dlatego odpowiadają dowodom in situ. Należy to odróżnić od metod in vitro, w których wykrywanie odbywa się w probówce. Metoda została opracowana w XX wieku przez naukowców Joe Galla i Mary Lou Pardue.

Od tego czasu technologia ewoluowała. Podczas gdy w tamtych czasach stosowano sondy radioaktywne, na przykład obecnie stosuje się sondy znakowane fluorescencyjnie z wiązaniem kowalencyjnym z cząsteczkami markera.

Funkcja, efekt i cele

Do wykrywania aberracji chromosomowych, czyli anomalii chromosomalnych, których nie można wykryć w kariogramie, zwykle stosuje się hybrydyzację in situ. Oznacza to, że metoda ta jest zawsze stosowana, gdy choroby dziedziczne mają być rozpoznane w czasie ciąży.

Ponieważ aberracje chromosomowe są problemem, którego nie należy dziś lekceważyć, zastosowanie tej metody z czasem wzrosło. Hybrydyzacja zachodzi na bazie natywnych komórek z płynu owodniowego matki. Podstawą technologii jest wiązanie oznaczonej kolorem sondy z częściami DNA. Dzięki oprawie liczbę kopii można później ocenić pod mikroskopem, ponieważ poszczególne kopie emitują sygnał świetlny i dzięki temu mogą być widoczne pod mikroskopem. Istnieją różne procedury. Analiza odbywa się natychmiast po związaniu.

W tym przypadku używany jest barwnik fluorescencyjny, taki jak biotyna, który jest bezpośrednio związany z sondą DNA. W przypadku pośredniej metody hybrydyzacji in situ ocena nie może nastąpić natychmiast po hybrydyzacji, ponieważ substancje fluorescencyjne mogą wiązać się z sondą dopiero po hybrydyzacji. Ta pośrednia metoda jest stosowana częściej niż bezpośrednia, ponieważ uważa się, że jest bardziej czuła. Oprócz specyficznych dla chromosomów centrometrycznych sond DNA istnieją również sondy DNA specyficzne dla locus, sondy bibliotek DNA specyficzne dla chromosomu i porównawcze hybrydyzacje genomów.

Sondy centrometryczne DNA specyficzne dla chromosomów mogą być używane do wykrywania chromosomowych anomalii numerycznych. Oznacza to, że są używane głównie wtedy, gdy istnieje podejrzenie, że chromosomy są zduplikowane lub usunięte. Sondy DNA specyficzne dla lokalizacji są szczególnie przydatne do wykrywania minimalnych mutacji, których nie można wykryć na kariogramie. Sonda biblioteki DNA specyficzna dla chromosomu jest używana w szczególności do wykrywania insercji i translokacji.

Z drugiej strony porównawcza hybrydyzacja genomu to wszechstronna analiza strat i zysków w materiale chromosomowym. Obecnie hybrydyzacja in situ jest bardzo ważna w diagnostyce różnych mutacji chromosomów.W diagnostyce zespołu Downa sondy wiążą się np. Z chromosomem 21. W tym celu zwykle stosuje się sondy specyficzne dla chromosomu, które można zastosować w przypadku podejrzenia tej choroby.

Podejrzenie może się pojawić np. Wtedy, gdy rodzice już wcześniej urodzili dziecko z chorobą i obraz USG jest nieprawidłowy. Jeśli występuje wiązanie potrójne zamiast podwójnego, a tym samym wyprowadzany jest sygnał potrójnego koloru, diagnoza jest uznawana za potwierdzoną.

Ryzyko, skutki uboczne i niebezpieczeństwa

W przeciwieństwie na przykład do PCR, hybrydyzacja in-situ jest znacznie mniej podatna na kontaminację. Ponadto czas potrzebny na ten proces jest znacznie krótszy. Jednakże, ponieważ w szczególności zarodki tworzą wzory chromosomowe, pozostałej części rozkładu chromosomów, a tym samym statusu genetycznego innych komórek, nie można wywnioskować z danego wzoru.

Sygnały kolorowe mogą również nakładać się lub pozostawać niewidoczne z innych powodów. W rezultacie hybrydyzacja in situ jako narzędzie diagnostyczne jest stosunkowo podatna na błędy podczas ciąży. Mogą pojawić się błędne diagnozy, a rodzice mogą zdecydować, że nie będzie zdrowego embrionu. W celu zmniejszenia podatności na błędy hybrydyzacji in situ przynajmniej dwie komórki zarodkowe powinny być badane jednocześnie. Badając dwie komórki równolegle, istnieje obecnie tylko znikome ryzyko błędnej diagnozy.

W takim przypadku rodzice mogą całkowicie polegać na diagnozie. Hybrydyzacja in situ nie jest oferowana każdej kobiecie w ciąży, ale tylko kobietom z grupy ryzyka. Niemniej jednak kobietom w ciąży nie odmawia się tego typu diagnozy na własne życzenie. Nieprawidłowe wyniki USG lub nieprawidłowe surowicy mogą skłonić lekarza do zaproponowania procedury diagnostycznej. Chociaż dużą część, ale nie wszystkie aberracje chromosomowe można zdiagnozować za pomocą hybrydyzacji in situ.

Dlatego hybrydyzacji in situ nie wolno nigdy przeprowadzać samodzielnie, ale zawsze należy ją stosować w połączeniu z konwencjonalnym testem chromosomów. Opieka nad kobietą w ciąży odgrywa ważną rolę w tym zabiegu. Przed analizą następuje uzasadniona dyskusja z przyszłą matką na temat metody diagnostycznej, która wyjaśnia zagrożenia, możliwości i ograniczenia technologii.